納米粒子nanoparticles(NPs)具有出色的物理化學特性，在生物醫學中被廣泛用于成像，診斷和治療。但隨著研究的深入，人們研究發現，NPs存在著許多生物特性，在進入生物體后可以與多種內源蛋白相互作用，從而發揮生物活性，如前文書中的NDs可以抑制實體瘤的自噬從而提高ATO抗實體瘤的療效。但是，這些NPs在被吸收后對于蛋白功能和隨之而來的生物效應有何影響還知之甚少。

本文的主角依然是NDs，與之前不同的是這次沒有其他藥物聯合應用，單獨探究NDs的藥理作用與機理。

2019年4月29日發表在Materials horizons上，IF：14.356，通訊作者：宋海云，單位：上海交通大學公共衛生學院

Pull-down實驗以及蛋白質譜法確定NDs靶點

A549細胞離心，用PBS充分洗滌后加入裂解液 ，蛋白酶抑制劑以及磷酸酶抑制劑等，再將澄清的上清液與ND在4℃下在搖床上孵育4小時，ND與細胞中的蛋白質充分結合，ND-蛋白質復合物用washing buffer洗滌三次，ND表面結合的蛋白質再用5%甲酸洗脫，胰蛋白酶消化過夜。再通過C-18色譜柱純化，并在Lineal Trap Quadropole離子阱質譜儀上分析。

待鑒定的蛋白分為以下幾類：跨膜受體、細胞骨架、伴侶分子、酶、信號轉導分子和轉錄因子。（圖1）結果發現，TβRⅡ是ND表面富集最多的蛋白，質譜檢測到14種TβRII獨特肽，覆蓋其26.3％的完整蛋白序列。而TβRⅠ的豐度較低。TβRⅠ與TβRⅡ都是TGFβ信號通路的主要成分，這些發現暗示ND和TGFβ介導的生物學功能之間存在聯系。（圖2a）類似的結果也在下拉實驗中體現。NDs與TβRⅡ相互作用，而NDs與TβRⅠ的相互作用超過儀器檢測的極限。（圖2a）因此，NDs可能通過TβRⅡ和TβRⅠ之間的動態二聚作用間接地與TβRⅠ相互作用。

圖1

圖2

在與TGFβ配體結合后，TβRⅠ和TβRⅡ會經歷胞吞作用，并隨后以稱為回收內體的早期內體的形式進行回收。于是作者研究NDs與TβRⅠ和TβRⅡ相互作用是否會影響這些受體的細胞內運輸。在對照組細胞中，只有低水平的TβRⅡ和TβRⅠ與溶酶體marker Lamp1共定位，這表明該細胞器中發生了TGFβ受體的基礎周轉。NDs治療大大增加了溶酶體定位的TβRⅡ的水平。另外，NDs也能增強TβRⅠ的溶酶體定位。（圖2c,d）這些結果表明對NDs的吸附阻止了TGFβ受體向再循環內體的分選。盡管TβRI可能不直接結合ND，但其與TβRII二聚的能力使其對細胞對ND的吸收敏感。作者進一步研究NDs攝取對A549細胞中這些受體蛋白質水平的影響。作為對照，用NDs溫育不影響TGFβ信號成分Smad2和Smad3或跨膜受體Lrp6的細胞水平。相反，它很大程度上消除了TβRII和TβRI的水平。（圖2e）

圖3

作者繼續探究NDs介導的受體降解對TGFβ信號轉導活性的生物學影響，TGFβ信號轉導活性在癌癥侵襲和轉移中起關鍵作用。劃痕實驗結果表明NDs能夠抑制癌細胞的遷移。（圖3a-c）與劃痕結果一致，transwell結果也顯示NDs能夠抑制TGFβ誘導的侵襲。（圖3d-f）

接下來，為了更好的模擬臨床上腫瘤的3D特征，作者開展了腫瘤類器官實驗，在3維培養基中驗證NDs對A549細胞衍生的腫瘤類器官的影響。在TGFβ配體存在的情況下，球形腫瘤類器官的形狀變得不規則延伸。但是，NDs可以抑制TGFβ誘導的腫瘤細胞延伸，并且逆轉腫瘤細胞形態的改變。（圖4a-c）在證明了NDs對體外培養的癌細胞和腫瘤類器官轉移的影響后，作者接下來動物體內繼續探索。（圖4d）微靜脈注射A549細胞構建轉移瘤模型，在對照組小鼠的肺和肝中形成許多轉移性腫瘤結節，微靜脈給予NDs（每三天一次，每只小鼠80μg）時間窗為18天，結果發現大大減少這些器官中轉移性腫瘤結節的數量。（圖4，f）并且，HE染色結果也顯示密集增殖的癌細胞嚴重破壞肺和肝的原始結構，而NDs可以大大減輕這些組織損傷。（圖4e,f）這些結果證實了注射NDs可以抑制腫瘤體內轉移。

圖4

最后，作者檢查NDs對肺和肝轉移性腫瘤進展的影響。TGFβ信號通路的激活可以影響腫瘤相關巨噬細胞TAM的數量并且提高M2/M1的比例。而阻斷TGFβ信號通路可以促進M1-TAM極化。作者利用熒光激活細胞分選分析來測量腫瘤組織中TAM和M2-TAM的水平。（圖5a）CD11b和F4/80是TAM的細胞表面marker蛋白，CD206則是M2-TAM的marker蛋白。流式細胞儀分析表明，NDs處理顯著降低浸潤免疫細胞中TAM的百分比，并顯著降低了總TAM中M2-TAM巨噬細胞的比例。（圖5a-c）并且，通過免疫組織熒光染色檢測腫瘤組織切片中浸潤的TAM和M2-TAM的水平時，也觀察到了相似的結果。（圖5d）

圖5

總結

這篇文章的亮點有兩個，其一在于作者將目光聚集在“不起眼”的藥物載體NDs上，闡明NDs進入機體后對于腫瘤細胞的作用。其二在于藥物作用靶點的尋找，通過蛋白質譜和下拉實驗證實NDs表面結合的蛋白為TβRⅡ，在確定了靶點之后再進一步探究給予NDs后TGFβ信號通路下游的變化以及腫瘤細胞特性的改變。這篇文章也為尋找藥物靶點提供了新的思路。